MilliporeECL發(fā)光液哪些因素會影響信號的強(qiáng)弱呢？
瀏覽次數(shù)：2252發(fā)布日期：2022-04-21
MilliporeECL發(fā)光液以化學(xué)熒光發(fā)光方法檢測蛋白質(zhì)或核酸類生物大分子。其原理是，蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉(zhuǎn)移到印跡膜上，以抗體及辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的第二抗體結(jié)合膜上的目的蛋白，或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用MilliporeECL發(fā)光液A液和B液等體積的混合工作液，在可見光下室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)分鐘至數(shù)小時。
MilliporeECL發(fā)光液哪些因素會影響熒光信號的強(qiáng)弱呢？
1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒(也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過某種化合物)、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時，我曾經(jīng)提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短的時間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。
b.保鮮膜的化工原料或拉制過程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價的保鮮膜問題尤多。
目前，國產(chǎn)的就“妙潔”比較過關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。
如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。
2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過水會吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜*干掉。某些信號較弱的ECL，膜*干掉后熒光會消失；較好的試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但*吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。
3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時，包裹保鮮膜時要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過度消耗，呈線條狀淬滅。
4.在膜放入壓片夾之前，好肉眼觀察一下熒光信號的強(qiáng)弱，這有利于判斷實驗可能出現(xiàn)的問題。很多人提問看見很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅(閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號)造成的；有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應(yīng)該問題不大，而問題主要是淬滅。如果你省略這個步驟，那問題就非常復(fù)雜了，因為之前任何操作都可能導(dǎo)致白板，根本無法判斷。
